一、常用動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的比較

　　動(dòng)脈粥樣硬化模型所用的動(dòng)物有鼠,、兔,、豬、狗,、猴,，依上述理想動(dòng)物模型的要求最常用的是兔、豬和鼠,。各種動(dòng)物誘導(dǎo)方法和形成特征的差異,，見表22-1。

　　表22-1 動(dòng)脈粥樣硬化模型的種類

　　動(dòng)物種類疾病誘導(dǎo)方法特征

　　鴿自然發(fā)生,，或高脂飲食

　　鼠高脂膳食高脂血癥,，肥胖

　　大白兔高脂膳食高脂血癥，肥胖

　　血栓性血管壁損害纖維增厚,，粥樣硬化

　　新西蘭兔非剝離性內(nèi)皮損害細(xì)胞纖維內(nèi)膜增厚

　　進(jìn)行性病變,，內(nèi)膜增厚

　　豬高脂膳食，壁損害極似人類病變

　　狗高脂膳食

　　猴高脂膳食好發(fā)冠狀動(dòng)脈硬化

　　二,、動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型制作過程

　　主要介紹豬和兔兩種動(dòng)物模型的制作過程,。因其容易獲得、價(jià)格便宜,、操作簡單,，常為首選動(dòng)物。

　　1.豬的動(dòng)物模型

　　健康雄性中國小型豬,，按統(tǒng)計(jì)學(xué)需要,，自定數(shù)量。5～6月齡,，稱其體重并記錄,，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,，每組數(shù)量相等，單籠飼養(yǎng),，對照組只給基礎(chǔ)飼料,，實(shí)驗(yàn)組基礎(chǔ)飼料每只動(dòng)物按25g·kg-1/d分兩次給予，上午在少量基礎(chǔ)飼料中拌入10%蛋黃粉和1.2%膽固醇,，待吃完后再添足飼料,。每月根據(jù)體重變化情況調(diào)整飼料量。兩組均自由攝水,。為使動(dòng)脈粥樣硬化模型更接近人的病變,，可采用間接飼養(yǎng)法，于第17周停喂膽固醇和蛋黃粉4周,，到第21周再恢復(fù),，并不再調(diào)整飼料量，直至第29周,。

　　2.兔的動(dòng)物模型

　　兔可選日本大白兔或新西蘭白兔(常用作內(nèi)膜剝脫造型),。8周齡或成年兔，稱其體重記錄,，隨機(jī)分組,，單籠飼養(yǎng)。每日給膽固醇1.5g,，上午以少量基礎(chǔ)飼料拌食,，待吃完后，再添足基礎(chǔ)飼料(每日每只120g),，對照組則只供基礎(chǔ)飼料,，兩組均自由攝水，飼養(yǎng)10周,。

　　以上均為高脂膳食法,，此外還有一種較常見的造型法是剝脫內(nèi)膜法，其操作是選用我國的大耳白兔,，每天只給0.5g膽固醇和大油1.5g,，蛋黃5g，1周后經(jīng)右股淺動(dòng)脈,，將3.5F球囊擴(kuò)張導(dǎo)管插至腹主動(dòng)脈20cm,，球囊充液膨脹至2個(gè)大氣壓緩慢拉出,，反復(fù)3次,。

　　三、相關(guān)指標(biāo)檢測

　　動(dòng)脈粥樣硬化的模型檢測,，大體包括病理形態(tài)學(xué)檢查,，免疫組織化學(xué)檢查以及生化檢查三個(gè)方面,。

　　1.病理形態(tài)學(xué)觀察

　　為了對比，豬在14～29周,，兔在5～10周,，處死兩組動(dòng)物(每周各一只)，作飼養(yǎng)過程的經(jīng)過觀察,。

　　(1)肉眼觀察主動(dòng)脈沿縱軸剪開,，蘇丹Ⅲ、Ⅳ混合染色,，投影格子計(jì)數(shù)法分別計(jì)算每條主動(dòng)脈內(nèi)膜總面積,，胸、腹主動(dòng)脈內(nèi)膜面積以及蘇丹Ⅲ,、Ⅳ染色陽性的脂質(zhì)條紋及隆起的纖維斑面積,，求出各類病變面積百分比。冠狀動(dòng)脈自心臟剝下,，沿縱軸切開,，蘇丹Ⅲ、Ⅳ混合液染色,，按上述方法計(jì)算每條冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜及其病變面積,，求出病變面積百分比。在實(shí)驗(yàn)組(豬)14周時(shí)脂質(zhì)條紋面積和纖維斑面積的百分比分別是9.64%和1.56%左右,。冠狀動(dòng)脈在主支近端1/3處可見纖維斑,。

　　(2)光鏡觀察從胸主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈典型病變處分別取材，常規(guī)石蠟切片,，厚4μm,，HE染色。用目鏡測微尺于200倍鏡下測量動(dòng)脈纖維斑或脂質(zhì)條紋的最大厚度及中膜厚度,，求其厚度比值,，兩組的值應(yīng)有顯著的差異。Masson染色片,，光鏡下400倍計(jì)數(shù)三個(gè)視野的腹主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈左前降支纖維斑內(nèi)胞漿紅染的梭形細(xì)胞(視為平滑肌細(xì)胞)數(shù),。其值在兩組間亦應(yīng)有顯著的差異。此外,，尚可在實(shí)驗(yàn)組見到內(nèi)膜缺損或裂隙,。

　　(3)電鏡觀察動(dòng)脈處死后迅速取材(部位同光鏡)，2.5g戊二醛及1%鋨酸雙重固定,，常規(guī)制備樣品,，以超薄切片機(jī)切片，乙酸鈉，檸檬酸鋁染色,，透射電鏡觀察,。掃描電鏡樣品經(jīng)逐級酒精脫水，臨界點(diǎn)干燥,，鍍膜后觀察,。在動(dòng)物模型組應(yīng)見到內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死脫落，見到髓磷脂小體,，細(xì)胞間連接變直變寬,，內(nèi)皮下間隙擴(kuò)大，有較多的平滑肌細(xì)胞(SMC)和泡沫細(xì)胞,。泡沫細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)密集成群分布的大脂滴和膽固醇結(jié)晶,，結(jié)晶使細(xì)胞核移位，胞體腫大,，部分泡沫細(xì)胞崩解,，如圖22-1所示。線粒體腫脹變性,，多數(shù)SMC胞漿內(nèi)充滿大量細(xì)胞器(粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),，高爾基體等)。但肌絲成分較少,，間質(zhì)可見彈力纖維增生,，細(xì)胞外脂質(zhì)沉積。

　　圖22-1 猴大動(dòng)脈硬化灶電鏡圖

　　喂飼一年形成的高膽固醇血癥猴的大動(dòng)脈呈高度動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(fattystreak)表面,，內(nèi)皮細(xì)胞呈復(fù)雜的凸凹不平,。一部分細(xì)胞接合分離、巨噬細(xì)胞祼落,、血小板粘著凝集,。

　　2.免疫組化定性定位觀察

　　目前市場上有多種免疫組化所需的抗原抗體提供，針對LDL的動(dòng)脈粥樣硬化斑可采用組化分析,，用相應(yīng)的LDL抗體為第一抗體的PAP法觀察LDL在動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)的分布,。LDL免疫活性陽性的顆粒主要分布在泡沫細(xì)胞周邊，在纖維斑塊內(nèi),，LDL顆粒呈彌漫性分布,，在病灶深部內(nèi)彈力板附近，有大量LDL顆粒聚集成帶狀,。

　　3.生化指標(biāo)檢測

　　在動(dòng)物飼養(yǎng)全過程中,，每周應(yīng)進(jìn)行一次血脂測定?？稍诙轨o脈取血或心臟直接抽血,。常測指標(biāo)有血清總膽固醇(TC)，某油三酯(TG)，低密度脂蛋白(LDL),，高密度脂蛋白(HDL)，載脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ),，載脂蛋白B(ApoB)等,，其動(dòng)物模型，除ApoAⅠ和HDL外,，其他各項(xiàng)指標(biāo)與對照組比較出現(xiàn)不同程度的升高,，尤其以TC、LDL,、ApoB最為顯著,。此外，血小板膜流動(dòng)性(PMF)及丙二醛(MDA)也可用作參考指標(biāo),。