一、Southern印跡法

　　Southern印跡法在鑒定LDL-R基因缺失突變中得到了廣泛的應(yīng)用,。采用多種限制性內(nèi)切酶切,，以LDL-R基因片段和外顯子特異性片段作探針，進(jìn)行雜交,，再放射自顯影,，對(duì)FH進(jìn)行限制性酶切圖譜分析,，可檢測(cè)FH患者的不同外顯子區(qū)域不同長(zhǎng)度的部分缺失類型,。

　　二、PCR法和核苷酸序列分析法

　　采用PCR法將包括點(diǎn)突變的受體基因片段擴(kuò)增,，再經(jīng)核苷酸序列分析即可發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變位點(diǎn),。影響酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變可經(jīng)PCR擴(kuò)增、特定的限制性酶切,、電泳,，檢測(cè)出異常片段。

　　三,、寡核苷酸探針法

　　本法采用的是一對(duì)寡核苷酸探針,，其中一個(gè)與正?；蝽樞蚧パa(bǔ)，另一個(gè)與突變序列互補(bǔ),，因此需用到多種特異的寡核苷酸探針,，是鑒定點(diǎn)突變的一種快速而簡(jiǎn)便的方法，當(dāng)一個(gè)或二個(gè)點(diǎn)突變?cè)谀骋惶囟ㄈ巳褐谐蔀橥蛔兊闹饕驎r(shí),，就可建立這種方法對(duì)某一地區(qū)的某一主要突變進(jìn)行篩查,。

　　四、RFLP連鎖分析法

　　限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)是采用不同的限制性核酸內(nèi)切酶酶切和多種cDNA片段探針,，根據(jù)DNA多態(tài)性片段的出現(xiàn),，確定LDL-R基因的連鎖相。

　　本法需進(jìn)行家系分析,，多態(tài)位點(diǎn)必須有一個(gè)以上是雜合的,，并且要排除細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)基因重組對(duì)多態(tài)位點(diǎn)的影響。

　　五,、長(zhǎng)鏈PCR法

　　常規(guī)的PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度不超過3kb,，不適合檢測(cè)大片段的受體基因缺失突變，Southern印跡法亦繁瑣復(fù)雜,，近年來(lái)長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)的研究為檢測(cè)LDL-R開辟了新途徑,。下面詳細(xì)介紹由周天鴻等建立的長(zhǎng)鏈PCR法在檢測(cè)LDL-R基因大片段缺失突型中的應(yīng)用。

　　引物：設(shè)計(jì)5對(duì)寡核苷酸引物,，見表20-6,。

　　表20-6 PCR擴(kuò)增引物序列

　　PCR引物核苷酸序列

　　PA15’CAACACACTCTGTCCTGTTTTCCAG3’

　　PA25’GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA3’

　　PB15’AGTCTGCATCCCTGGCCCTGCGCAG3’

　　PB25’AGGGCTCAGTCCACCGGGGAATCAC3’

　　PC15’CCAAGCCTCTTTCTCTCTCTTCGAC3’

　　PC25’CCACCCTCCGCCTTCCCGTGCTCAG3’

　　PD15’TCCATCGACGGGTCCCCTCTGACCC3’

　　PD25’AGCCCTCATCTCACCTGCGGGCCAA3’

　　PE15’AGATGAGGGCTCCTGGTGCGATGCC3’

　　PE25’GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA3’

　　DNA：由健康人和FH患者外周血制備DNA。

　　長(zhǎng)鏈DNA擴(kuò)增：采用引物PA1和PA2擴(kuò)增LDL-R基因中外顯子5～10的片段,。

　　PCR擴(kuò)增制備探針：采用引物PB1/PB2,、PC1/PC2、PD1/PD2,、PE1/PE2制備LDL-R基因外顯子7,、8、9,、10的同位素探針,。

　　PA1對(duì)應(yīng)于LDL-R基因外顯子5的5'端側(cè)翼序列，PA2對(duì)應(yīng)于外顯子10的部分序列,，此對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物為含外顯5～10的基因片段,。正常人得到1條7kbDNA片段，F(xiàn)H患者得到2條DNA片段,，一條7kb,，一條4.4kb，表明FH患者是雜合子，其一個(gè)LDL-R等位基因正常,，另一個(gè)等位基因外顯子5～10之間存在著一個(gè)2.6kb的缺失,，見圖20-4。將產(chǎn)物用EcoR1酶切,，得到的產(chǎn)物電泳圖譜見圖20-5,。最后用PB、PC,、PD,、PE4對(duì)引物，以正?；虻拈L(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物為模板,，用PCR法獲得外顯子7、8,、9,、10的探針，將這些探針分別與正?；虻耐蛔兓虻拈L(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物雜交,，其結(jié)果見表20-7。

　　采用長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)可快速,、簡(jiǎn)單,、準(zhǔn)確地檢測(cè)大片段的缺失突變，可應(yīng)用于臨床基因診斷,，尤其是有遺傳背景的FH高危人群的基因篩查,。

　　圖20-4 FH患者LDL-R基因缺失示意圖

　　圖20-5 長(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物電泳示意圖

　　a：FH患者基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;b：健康人基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;c：CNA分子量標(biāo)記。

　　表20-7 LDL-R突變基因和正?；蜷L(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物與外顯子7～10探針的雜交結(jié)果

　　長(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物探針外顯子7探針外顯子8探針外顯子9探針外顯子10

　　突變基因--++

　　正?；?+++

　　(劉芳)