載脂蛋白CⅢ基因位于11號染色體與載脂蛋白AⅠ-AⅣ形成一基因族,，它位于載脂蛋白AⅠ下游,，有三個內(nèi)含子和四個外顯子。目前對載脂蛋白CⅢ基因3'末端非編碼區(qū)C-G對換產(chǎn)生一個Sac-Ⅰ酶切位點與冠心病的關(guān)系未有定論,。用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增載脂蛋白CⅢ基因3'末端233bp,，再用Sac-1酶切擴增產(chǎn)物，可以檢測載脂蛋白CⅢ基因3'末端的突變及其與動脈粥樣硬化相關(guān)性,。本節(jié)采用PCR-RFLP檢測ApoCⅢ基因型,。

　　一、儀器與試劑

　　1.儀器：電泳儀,，基因擴增儀,。

　　2.試劑：TaqDNA聚合酶,，dNTP，DNA參考物,，Sca-1酶,。

　　二、操作方法

　　1.模DNA提取

　　取用EDTA抗凝全血100μl加試劑(0.32mol/L蔗糖,，5mmol/l MgCl2,1%TritonX-100,0.01mol/L Tris-HClpH7.6),，振搖至溶解均勻透明，3000r/min離心10min,棄上清,，沉淀部分加0.9NaCl溶液洗一次,，加預(yù)冷試劑Ⅱ(75mmol/l NaCl,24mmol/L EDTA)100μl，20%SDS15μl,，蛋白酶K10μl(6g/L)于65℃水浴4h,，加200μl酚和氯仿：異戊醇(24：1)各提兩次，上清加無水乙醇1.0ml放置于-20℃2h,，以12kr/min離心5min,，真空干燥后加50μlTE緩沖液溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　2.多聚酶鏈反應(yīng)

　　Primer1：5'-GTGACC GAT GGC TTC AGT TCC CTG-3',，primer2:5'-GGt AGG AGAGCA CTC AGA ATA CA-3',。反應(yīng)總體積為50μl，擴增緩沖液所含物質(zhì)終濃度為：Tris-HCl,，pH8.3,，67mmol/L;MgCl225mmol/L;KCl 50mmol/L;明膠0.01%，dNTP各0.2～0.5μmol/L,，模板約10μg,，加40μl液體石蠟，94℃預(yù)變性4min,，加Tag聚合酶1.5U,，以93℃1min、65℃1.5min,、72℃1.5min，循環(huán)30次,。

　　3.擴增產(chǎn)物酶切

　　取擴增產(chǎn)物20μl加入NH4AC20μl,，再加300μl無水乙醇混均置-20℃1h，10000r/min離心7min棄上清,，干燥后加Sac-1酶液10μl37℃保溫2h,。

　　4.擴增產(chǎn)物堿基對分子量測定

　　采用GB公司產(chǎn)DNamarker,以已知DNA片段bp數(shù)相對應(yīng)的電泳遷移距離，取半對數(shù)作圖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,，再根據(jù)等測定擴增產(chǎn)物DNA片段移動距離在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其bp數(shù),。

　　三,、結(jié)果分析

　　采用本節(jié)設(shè)計引物擴增產(chǎn)物為ApoCⅢ基因3'非編碼區(qū)233bp，該產(chǎn)物經(jīng)Sac-1酶切可出現(xiàn)三種結(jié)果;①酶切后仍為一條帶,，電泳遷移率未發(fā)生改變,，為S1S1純合子;②酶切后除原始帶外又增加了兩條帶，查標(biāo)準(zhǔn)DNa marker曲線在158bp和75bp相同,，為S2S2雜合子;③酶切后原始帶消失,，出現(xiàn)兩條新帶，其電泳遷移率與158bp和75bp相同,，為S2S2純合子,。S2為擴增的基因產(chǎn)物中C-G對換增加一個酶切位點。

　　檢查100名正常人中有S2雜合子28名,，純合子2名;68名冠心病人中S2雜合16名,，純合子4名，它們的頻率變化見表(19-4),。S2基因頻率兩組間無明顯差別,。

　　表19-4 載脂蛋白CⅢ基因Sac-Ⅰ酶切頻率表

　　級別n基因型頻 率

　　S1S1S1S2S2S2S1S2

　　正常人100702820.840.16

　　冠心病68481640.820.176

　　X=0.079,p>0.05(兩組比較)

　　(徐瓊)