一,、高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定

　　血漿中脂蛋白有多種，測(cè)定其各自的含量對(duì)于了解機(jī)體正常及疾病過程中脂質(zhì)代謝狀況有重要的臨床意義,。HDL是一組不均一的脂蛋白顆粒,，其膽固醇含量占血漿總膽固醇量的25%～35%。由于血漿中所有脂蛋白均含有膽固醇,，因此,，只有先分離出HDL才能對(duì)其進(jìn)行定量。分離HDL的方法中,，沉淀法是目前臨床使用最多的方法,，操作簡(jiǎn)便快速。沉淀法原理是利用多聚陰離子和二價(jià)陽(yáng)離子共同作用于脂蛋白,，并選擇性地使含ApoB的VLDL和LDL脂蛋白沉淀,，再測(cè)定含HDL的上清液膽固醇，即高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),。定量HDL全量是很困難的,，因?yàn)樗堑鞍踪|(zhì)和脂類的混合物，故以測(cè)定HDL中所含膽固醇含量作為HDL定量依據(jù),。

　　要測(cè)定血清中HDL-C,，就必需先沉淀HDL以外的脂蛋白，即VLDL和LDL,。使血清中VLDL和LDL沉淀的試劑很多,，常用的有四種：①肝素-錳沉淀法，該法操作簡(jiǎn)便易行，一旦遇上血脂升高的標(biāo)本,，有沉淀不完全的差異;②硫酸葡聚糖-鎂法,，該法也簡(jiǎn)單易行，試劑較貴而難買到;③聚乙二醇法,，雖然簡(jiǎn)便易行,，若遇高脂血癥標(biāo)本，其重復(fù)性差;④磷鉬鎢酸-鎂法,，操作簡(jiǎn)便易行,，結(jié)果準(zhǔn)確，是目前臨床推薦使用的方法;⑤另有一種不沉淀VLDL和LDL也可直接測(cè)定HDL的方法,，稱之為直接測(cè)定法,。其原理是，先用一種封阻血清VLDL和LDL,，而不封阻HDL,，當(dāng)測(cè)膽固醇的酶試劑加入后，酶可作用于HDL的膽固醇進(jìn)行化學(xué)反應(yīng),，測(cè)出其濃度,，但酶試劑就無法使已被試劑封阻的VLDL和LDL的膽固醇進(jìn)行反應(yīng)，這種直接法操作更為簡(jiǎn)便,，無需離心等繁雜步驟,，便于在自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行HDL-C測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠,，缺點(diǎn)是成本過高,。下面僅介紹目前推薦使用的方法。

　　(一)原理

　　磷鎢酸-鎂(PTA-Mg2+)沉淀血清中含ApoB的脂蛋白(VLDL,、LDL),，上清液中只含HDL，用酶法測(cè)定上清液中膽固醇,，即HDL-C,。

　　生成的醌亞胺與HDL中的CE及FC成正比。

　　2.試劑組成

　　(1)沉淀劑磷鎢酸鈉4g溶于50ml雙蒸水中,，加入1mol/l NaoH16ml,，充分?jǐn)嚢韬螅偌与p水至100ml,，調(diào)pH到7.6,。再取40ml此溶液，加2mol/l MgCl210ml,，混勻,，再加水至100ml，此為應(yīng)用液。

　　(2)膽固醇酶法測(cè)定試劑(同第十五章)

　　(3)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)參考液(同第十五章)

　　3.操作

　　(1)空腹12h,，抽取靜脈血，不抗凝,，分離血清備測(cè),。于24h內(nèi)操作完畢。

　　(2)其他操作同前,。

　　4.注意事項(xiàng)

　　(1)室溫以15～20℃為宜,，<15℃或>30℃時(shí)應(yīng)增加或減少靜置時(shí)間，離心轉(zhuǎn)速要恒定一致,。

　　(2)離心沉淀后,，要立即吸出上清進(jìn)行測(cè)定，否則結(jié)果偏離不準(zhǔn),。

　　(3)若血清TC超過500mg/dl時(shí),，上清液會(huì)出現(xiàn)混濁，表明有部分膽蛋白漂浮在上清液中未沉淀完全,，此時(shí)將血清稀釋重新沉淀,，其所測(cè)值乘以稀釋倍數(shù)。

　　(二)血清HDL-C選擇遮敝直接測(cè)定法,。

　　1.原理

　　含反應(yīng)抑制劑的陰離子表面活性劑加入血清中后,，與CM、VLDL和LDL緊密結(jié)合,，少量與HDL結(jié)合,。爾后，再加入反應(yīng)促進(jìn)劑的聚陰離子表面活性劑后,，HDL溶化并釋放出膽固醇,，與膽固醇測(cè)定試劑進(jìn)行反應(yīng)，達(dá)到僅測(cè)出高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)的目的,，其反應(yīng)全過程為：

　　2.試劑(第一化學(xué))

　　RⅠ：前處理液(第一反應(yīng)液)

　　RⅡ：第二反應(yīng)液(可溶性表面活性劑)及顯色液

　　HDL-C參考血清

　　3.操作

　　按雙試劑雙波長(zhǎng)法在CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè),，有關(guān)參數(shù)如表16-1所示。

　　表16-1 HDL-C檢測(cè)參數(shù)

　　名稱參數(shù)

　　分析方式終點(diǎn)法

　　標(biāo)本用量3μl

　　RⅠ體積300μl

　　RⅡ體積100μl

　　第一試劑時(shí)間3～4min

　　第二試劑時(shí)間5～6min

　　雙波長(zhǎng)[560][600]nm

　　標(biāo)本濃度按△A=A2-A1的吸光度計(jì)算

　　4.特點(diǎn)

　　(1)直接測(cè)定,，無需預(yù)處理,。

　　(2)操作簡(jiǎn)便，減少影響準(zhǔn)確性的因素,。

　　(3)標(biāo)本及試劑用量少,，準(zhǔn)確性高。

　　(4)抗干擾能力強(qiáng),，適合于自動(dòng)化分析,。

　　(5)該法CV為5%以下，回收率90%～110%。線性范圍(0～5.85mmol/L),。

　　5.注意事項(xiàng)

　　(1)待測(cè)血清標(biāo)本于當(dāng)日測(cè)試,，2～8℃保存，一周內(nèi)測(cè)定,，-20℃長(zhǎng)期保存,，對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。

　　(2)干擾物維生素C500mg/L,、膽紅素200mg/L,、Hb5.0g/L以下均不影響測(cè)定結(jié)果。

　　二,、血清低密度脂蛋白測(cè)定

　　LDL是一組不均一的脂蛋白顆粒,，其膽固醇含量約占總膽固醇的45%～50%。

　　測(cè)定血漿中LDL,，首先同樣要分離LDL,，其分離方法有超速離心法、聚陰離子沉淀法,、色譜法,、電泳法及計(jì)算法等。以聚陰離子沉淀法簡(jiǎn)便易于操作,，結(jié)果準(zhǔn)確可靠,。由于直接測(cè)定LDL有一定的困難，因?yàn)樗堑鞍踪|(zhì)脂類組成的顆狀結(jié)構(gòu),，膽固醇是其較為衡定的因素,，因此采用測(cè)定LDL中所含的膽固醇的濃度作為L(zhǎng)DL定量的依據(jù)。

　　另外,，還可以通過用Friedwal公式計(jì)算,，主要是利用血清TC、TG及HDL-C濃度測(cè)定結(jié)果,，即LDL-C=TC-HDL-C-(1/5)TG,。對(duì)脂代謝異常的高脂血癥，不能按此方法計(jì)算結(jié)果,。

　　(一)聚乙烯硫酸鹽(PVS)法

　　1.原理

　　生成的醌亞胺與上清液的TC含量成正比,。

　　2.試劑組成

　　(1)沉淀劑：聚乙烯硫酸鉀鹽0.7g/L、聚乙二醇獨(dú)甲醚170g/L,、乙二胺四乙酸5mmol/L,，混勻，4～21℃避光可保存一年,。

　　(2)酶法膽固醇測(cè)定試劑(同第15章),。

　　(3)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液：2.58mmol/L,。

　　3.操作

　　(1)空腹12h，采靜脈血,，3h內(nèi)分離完成血清以免脂蛋白之間相互交換和防止LDL降解,。-70℃可以保存數(shù)月之久。

　　(2)取200μl血清置于含有沉淀劑100μl試管中充分混勻,，室溫放置15min,3000r/min離心,，留上清測(cè)定膽固醇。

　　(3)按下表進(jìn)行操作：

　　空白管測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管

　　上清液(μl)　30

　　定值血清(μl)　　30

　　水(μl)30

　　膽固醇酶試劑(μl)2.02.02.0

　　混勻,，37℃6min，以空白管調(diào)零(500nm),，讀取光密度,。

　　(4)計(jì)算

　　血清LDL-C=TC-上清液膽固醇

　　(5)注意事項(xiàng)

　　標(biāo)本沉淀過程嚴(yán)格按要求進(jìn)行。吸取上清液時(shí),，注意輕吸,，別攪動(dòng)沉淀。

　　PVS法能將Lp(α)完全沉淀,，一般情況下,，正常人含量極少，一旦高脂血癥,、Lp(α)增高時(shí),，其測(cè)定值LDL-C應(yīng)為L(zhǎng)DL-C和Lp(α)-C之和。

　　(二)血清LDL-C直接測(cè)定法

　　1.原理

　　含反應(yīng)活性劑的試劑Ⅰ加入血清后,，與HDL,、VLDL和CM反應(yīng)，使其膽固醇水解并與酶反應(yīng)生成無色產(chǎn)物溶于介質(zhì)中,。再加入含溶解LDL的活性劑Ⅱ試劑,，使LDL水解并與其中的膽固醇試劑進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)生成紅色化合物，定量血清中LDL-C,。

　　以△A=A2-A1進(jìn)行運(yùn)算,，測(cè)出LDL-C的含量

　　2.試劑(第一化學(xué))

　　R1：去垢劑1、COD,、POD,、4-AAP。

　　R2：去垢劑2,、DSBmT,。

　　3.操作

　　按CL-7200型或其他型號(hào)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，有關(guān)參數(shù)如表16-2所示,。

　　表16-2　LDL-C檢測(cè)參數(shù)

　　名稱參數(shù)

　　分析方式終點(diǎn)法

　　標(biāo)本用量(μl)[3]

　　R1體積(μl)[300]

　　R2體積(μl)[100]

　　第一試劑時(shí)間5min

　　第二試劑時(shí)間5min

　　波長(zhǎng)(nm)[560][600]

　　4.特點(diǎn)

　　(1)直接測(cè)定,，無需預(yù)先處理,。

　　(2)操作簡(jiǎn)便，減少影響準(zhǔn)確性的因素,。

　　(3)標(biāo)本及試劑用量少,，準(zhǔn)確性高。

　　(4)抗干擾能力強(qiáng),，適合于自動(dòng)化分析,。

　　(5)該法CV為5%以下，回收率90%～110%,，線性范圍0～88mmol/L,。

　　5.注意事項(xiàng)

　　待測(cè)血清標(biāo)本于當(dāng)日測(cè)試，2～8℃一周內(nèi)保存,，-20℃以下長(zhǎng)期保存,，結(jié)果均不受影響。

　　三,、高密度脂蛋白亞組份膽固醇(HDL2-C,，HDL3-C)檢測(cè)

　　聚乙二醇20000沉淀法

　　1.原理：

　　HDL中主要組份為HDL2和HDL3。用聚乙二醇20000(PEG20000)作沉淀劑,，以不同濃度在不同pH條件下,，可將HDL2和HDL3分離開。95g/L聚乙二醇20000在pH6.5環(huán)境下可將血清中低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)沉淀,，離心后上清液中只含HDL,。170g/L聚乙二醇20000在pH7.5環(huán)境中，可將LDL,、VLDL,、HDL2沉淀，離心后上清液中只含HDL3,，以酶試劑側(cè)定各自上清液中膽固醇含量,，通過換算，計(jì)算出代表HDL各亞組分含量,。

　　2.試劑：沉淀劑Ⅰ：95g/L PEG20000,，pH6.5

　　沉淀劑Ⅱ：170g/LPEG20000，pH7.5,。

　　膽固醇酶應(yīng)用液及參考血清以試劑盒而定,。

　　3.操作方法：(以生化分析儀為例)按表16-3操作

　　表16-3 HDL-C亞組分測(cè)定操作步驟

　　加入物1管2管

　　血清100100

　　沉淀劑Ⅰ(μl)200-

　　沉淀劑Ⅱ(μl)-200

　　置混勻器上混勻2min，置室溫10min,，3000r/min離心20min,，上清液待測(cè)。

　　上清液于生化分析儀測(cè)定,，測(cè)定參數(shù)參照總固醇測(cè)定法,。

　　5.結(jié)果計(jì)算

　　HDL-C=上機(jī)測(cè)得結(jié)果×血清稀釋倍數(shù)

　　HDL3-C=上機(jī)測(cè)得結(jié)果×血清稀釋倍數(shù)

　　HDL2-C=HDL-C×HDL3

　　6.注意事項(xiàng)：

　　離心時(shí)間及速度一定要準(zhǔn)確;

　　離心上清液混濁者應(yīng)繼續(xù)離心直到清亮止;

　　四,、血清Lp(α)測(cè)定法

　　1.原理

　　血漿(清)中脂蛋白(α)(Lp(α))與Lp(α)的單克隆抗體(鼠)結(jié)合形成抗原抗體免疫復(fù)合物，有濁度改變,，測(cè)定溶液界質(zhì)中混濁度的光密度改變,，求其血漿中Lp(α)的含量。

　　Lp(α)+抗人Lp(α)→抗原抗體復(fù)合物→測(cè)定光密度

　　2.試劑與儀器

　　試劑(第一化學(xué));Lp(α)緩沖液(R1);Lp(α)抗體液(R2),。

　　儀器：生化分析儀(以CL-7200型為例)

　　3.操作方法

　　以△A=A2-A1進(jìn)行運(yùn)算Lp(α)濃度,。

　　4.定標(biāo)：

　　取Lp(α)定值液，用0.9%NaCl液稀釋,。

　　采用上述操作步驟,，按免疫測(cè)定法定標(biāo)，其操作方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖16-3所示,。

　　圖16-3 Lp(α)免疫測(cè)定法的反應(yīng)過程光密度變化值mAbs(A)及其檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(B)(CL-7200型)

　　上機(jī)參數(shù)(以CL-72OO型為例)

　　名稱LPA名稱LPA

　　測(cè)定方法Endpoint標(biāo)準(zhǔn)(1)0.72

　　標(biāo)本量16μl標(biāo)準(zhǔn)(2)1.44

　　R1試劑量280μl標(biāo)準(zhǔn)(3)2.88

　　R2試劑量40μl標(biāo)準(zhǔn)(4)5.75

　　反應(yīng)時(shí)間第一波長(zhǎng)5min標(biāo)準(zhǔn)(5)11.5

　　第二波長(zhǎng)4.99min波長(zhǎng)1.2[340][750]

　　5.注意事項(xiàng)：

　　(1)操作時(shí),，標(biāo)本和試劑無需處理;

　　(2)血漿或血清標(biāo)本均可檢測(cè)。標(biāo)本置2～21℃保存1周不變;

　　(3)標(biāo)本濃度超過定標(biāo)最高值時(shí),，應(yīng)用生理水稀釋后再測(cè);

　　(4)抗體試劑(R1)避免反復(fù)接觸;

　　(5)測(cè)定時(shí)避免日光直接照射。

　　五,、脂蛋白x的電泳分析

　　1.原理

　　血清脂蛋白x的組成中磷脂占66%,，蛋白質(zhì)僅占6%，在電場(chǎng)中因電荷少,，選擇電滲大小合適的瓊脂為電泳支持物,，則LpX向陰極移動(dòng)，而其他蛋白質(zhì)向陰極移動(dòng),，從而達(dá)到分離的目的,。用免疫沉淀法或聚陰離子沉淀法使其在瓊脂板上沉淀，對(duì)于LpX陽(yáng)性的血清可以在加樣孔的陰極端見到白色沉淀帶,。

　　2,、試劑

　　巴比妥緩沖液500mmol/L：pH8.6,離子強(qiáng)度0.05。

　　1%瓊脂用上述巴比妥緩沖液加熱配制,。

　　沉淀劑;每升中含MgCl20.1mol,，肝素2.5g及MaCl9g。

　　3.儀器：電泳儀,。

　　4.操作：

　　(1)制板 1%瓊脂糖加熱未冷卻前于一潔凈載玻片上均勻鋪開,。凝固后在一端2cm～3cm處打孔(直徑約2.5mm)。

　　(2)電泳　將血清20μl加于小孔內(nèi)(勿使外溢和有氣泡),。按瓊脂糖脂蛋白電泳操作,、搭橋、通電1mA,、40min,。

　　(3)漿瓊脂玻片浸在沉淀劑中30min后觀察結(jié)果(如Lp-x陽(yáng)性,，數(shù)min內(nèi)即出現(xiàn)沉淀線)，Lp-x濃度到3.3mg/dl上即可出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),。

　　正常值：正常人血清無Lp-x帶,。

　　(儲(chǔ)建中　吳翠華)