血清中膽固醇包括CE和FC,，酯型的CE占70%，F(xiàn)C占30%,。CE中的C3的-OH在LCAT作用下,，可分別結(jié)合亞油酸(43%)、油酸(24%),、軟脂酸(10%),、亞麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%),、硬脂酸(3%)等脂肪酸結(jié)合而成,。血清中膽固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL,、CM最少。血清總膽固醇測(cè)定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類,。

　　1.化學(xué)法

　　化學(xué)法一般包括：①抽提;②皂化;③毛地黃皂苷沉淀純化;④顯色比色四個(gè)階段,。代表性的方法有Sperry-Webb法，通過①～④步驟操作過程,。常規(guī)操作中多采用省去了②,、③?；蛘哂檬∪ア?、③步驟的Zak-Henly法及省去③步驟的Abell-Kendall法，現(xiàn)將此法作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法予以引用,。

　　2.酵法測(cè)定

　　CE在膽固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA,，TC再經(jīng)膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4膽甾烯酮和H2O2。再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量,，或者△4膽甾烯酮生成量,以作為TC的定量依據(jù),。該法是目前常規(guī)的應(yīng)用方法，快速準(zhǔn)確,，標(biāo)本用量少,，便于自動(dòng)生化分析儀作批量測(cè)定。

　　一,、Abell-Kendall改良法

　　1.原理

　　血清加入醇溶性氫氧化鉀,，使膽固醇從脂蛋白中分離出來(lái),，同時(shí)使膽固醇酯加水分解成游離膽固醇，加石油醚振搖,、抽提,，使膽固醇移入石油醚層，分離并取一定量的石油醚層,，蒸發(fā)至干,，再進(jìn)行Liebermann-Burchard 顯色反應(yīng)，620nm比色定量,。該法可用于基本功訓(xùn)練及組織細(xì)胞膽固醇的提取定量,。

　　2.試劑組成

　　代號(hào)種類濃度組　成貯存2～8℃有效時(shí)間

　　R1乙醇　優(yōu)質(zhì)純

　　R2石油醚　沸點(diǎn)68℃，特級(jí)純

　　R3水醋酸　分析純

　　R4無(wú)水醋酸　膽固醇分析用,，不含HCI

　　R5濃硫酸　分析純

　　R6KOH液33%(W/W)KOH10g+H2O20ml

　　R7乙醇性KOH液　R194ml+R66ml　臨用前配制

　　R8Liebermann　　　配制后

　　Burchard　R420體積+R51體積+R310體積　1h

　　試劑*　　　內(nèi)用完

　　R9膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液5.17mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品200mg+R1→100ml0

　　*：在三角燒瓶?jī)?nèi),，加入無(wú)水醋酸，于冰水中冷至10℃以下,，再慢慢加入濃硫酸,，混合，靜置10min,，又加冰醋酸混勻,，備用。

　　3.操作

　　圖15-1 血清膽固醇(Abell法)測(cè)定操作圖

　　按圖15-1操作,。

　　4.計(jì)算

　　標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

　　二,、酶法(CEH、COD-POD法)

　　首先將血清中膽固醇酯在膽固醇酯酶(CEH)水解為游離膽固醇和脂肪酸,，膽固醇在膽固醇氧化酶(COD)作用下,，生成△4-膽甾烯酮和H2O2，再H2O2經(jīng)過氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)參與下,，生成紅色醌亞胺色素,。

　　H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→紅色醌亞胺色素

　　(一)手工測(cè)定法

　　1.試劑組成

　　代號(hào)種類濃度組成貯2～8℃有效時(shí)間

　　Na2HPO450mmol/L

　　Na2H2PO450mmol/L

　　膽酸鈉3mmol/L

　　4-氨基安替比林0.82mmol/L

　　R1*ESPAS14mmol/L　　24h

　　Carbowax-60000.17mmol/L

　　CEH33U/L

　　COD117U/L

　　POD6700U/L

　　R2標(biāo)準(zhǔn)液5.17mmol/L用異丙醇溶解膽固醇

　　*混勻，調(diào)pH至6.70±0.10(25℃),，或購(gòu)買試劑盒,。酶以活性單位表示。

　　2.操作

　　按圖15-2操作,。

　　3.計(jì)算

　　標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

　　(二)自動(dòng)化分析儀測(cè)定

　　以CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)為例,。

　　1.試劑組成

　　A液：CEH、POD,、抗壞血酸氧化酶等,。

　　B液：COD、4-氨基安替比林等,。

　　圖15-2 血清膽固醇測(cè)定(酶法)操作圖

　　2.上機(jī)參數(shù)

　　項(xiàng)　目參　數(shù)

　　方　法終點(diǎn)法

　　波　長(zhǎng)雙波長(zhǎng)(540nm,，700nm)

　　反應(yīng)溫度37℃

　　試劑A反應(yīng)時(shí)間2～3min

　　試劑B反應(yīng)時(shí)間5～6min

　　樣本用量3μl

　　試劑A用量250μl

　　試劑B用量120μl

　　單位mmol/L

　　3.操作過程

　　4.計(jì)算

　　以△A=A2-A1,，根據(jù)同樣處理之標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)控物計(jì)算，打印結(jié)果,。

　　5.注意事項(xiàng)

　　(1)試劑與樣本量可根據(jù)分析儀要求按比例改變,。

　　(2)試劑在有效內(nèi)2～8℃避光食保存。

　　(3)膽固醇含量超過200mmol/L,，需用生理鹽水稀釋再測(cè),。